Ｉ 型膠原支架材料與人脂肪干細胞體外生物相容性研究

張云松，高建華，魯峰，朱茗，廖云君
（南方醫科大學南方醫院整形外科，廣東廣州５１０５１５）
人脂肪干細胞具有增殖能力和多向分化潛能，對多種組織的損傷具有良好的修復作用，而且取材方便，是組織工程研究中的重要種子細胞之一［１，２］。理想的種植材料應具有良好的生物相容性，對細胞、組織等無毒性。不同材料對細胞的生長、分化和黏附均有不同的影響，因而種子細胞能否在支架材料上良好生長，并表達自身特異性功能是目前組織工程研究的一個熱點。本實驗首次用人脂肪干細胞與Ｉ型膠原支架材料進行體外混合培養，了解支架材料對細胞粘附、生長、增殖等功能的影響，以便尋找適宜的脂肪組織工程細胞載體，為進一步的體內實驗提供理論依據。
１材料與方法
１．１試劑
ＤＭＥＭ、特級胎牛血清由Ｇｉｂｃｏ公司生產；Ｉ型膠原酶、胰蛋白酶、Ｉ型膠原支架材料、四氮唑復合物（ＸＴＴ），硫酸酚嗪甲酯和二甲基亞砜均購自Ｓｉｇｍａ，１
孔細胞培養板購自Ｃｏｒｎｉｎｇ。
１．２方法
１．２．１脂肪組織來源的脂肪干細胞（ＡＤＳＣＳ）原代、傳代培養［２］取人吸脂術中吸出的脂質部分，用緩沖液反復沖洗，剪刀剪碎。０．１％膠原酶３７℃消化４０ｍｉｎ，期間需反復震蕩混勻１次，使用等量體積的完全培養基中和后，離心１３００×ｇ５ｍｉｎ，去上清，沉淀混懸后使用肽盼藍染色檢測細胞活性，加入１０％ＤＭＥＭ培養基中，３７℃５％ＣＯ２孵箱培養過夜。待細胞生長融合達８０％即可傳代，取第３￣４代細胞供實驗用。
１．２．２細胞－支架復合物的形成將膠原蛋白支架材料裁制成１０ｍｍ ×１０ｍｍ ×１ｍｍ大小，利用紫外線照射及酒精浸泡消毒，培養液平衡后待用。培養的脂肪干細胞消化后制成細胞懸液，細胞密度為２×１０５／ｍｌ，表面種植０．２ｍｌ細胞懸液，靜置４ｈ后，加入含２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培養液，３７℃、 ５％ＣＯ２培養箱中培養。
１．２．３倒置顯微鏡觀察細胞接種支架后，動態觀察細胞在支架上粘附、伸展、生長、分裂情況。
１．２．４細胞黏附率檢測根據Ｋａｓｔｅｎ報道的方法做［３］了部分改進。取２４孔培養板，在孔內植入備用的膠原蛋白支架材料７塊，大小約１０ｍｍ ×１０ｍｍ ×１ｍｍ將細胞濃度為２×１０５／ｍｌ的細胞懸液０．２ｍｌ滴加到料上，靜置４ｈ后，置于孵育箱中復合培養４ｈ，換于另一平皿，加入培養液，將原平皿中細胞消化收集，計數儀計數，得出流失的細胞數；細胞材料復合物培養２４ｈ后，在培養液中輕輕晃動，換于另一平皿，重復上述步驟，得出未黏附細胞數。粘附率＝（接種細胞數－流失細胞數－未粘附細胞數）／（接種細胞數－流失細胞數）×１００％。
１．２．５ＸＴＴ比色法［４］測定細胞增殖狀況將膠原支架材料７塊（５ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍ）分別置于９６孔培養板中，并設７孔為不加材料的空白對照組，各４個復孔。
將ＡＤＳＣＳ以１×１０４／孔接種于材料及空白孔，置３７℃５％ＣＯ２孵箱培養３、５、７ｄ，以主波長４５０ｎｍ，參比波長６３０ｎｍ在酶標儀上比色，測定吸光度Ａ值。
１．２．６掃描電鏡觀察細胞－支架復合物體外培養至３ｄ和７ｄ時，取出材料，３％戊二醛固定，梯度酒精脫水，臨界點干燥，橫截面表面噴金，掃描電鏡觀察。
１．２．７統計學處理所得數據采用ＳＰＳＳ１１．０軟件包進行統計分析，Ｐ＜０．０５為差異有顯著意義。
２結果
２．１細胞－支架復合物倒置顯微鏡觀察
剛接種的細胞呈圓形，在支架材料內均勻分布；透光性差，２４ｈ內細胞伸展、黏附，透光性增加，不易觀測。２￣３ｄ已完全伸展變形，以三角形和梭形為主，呈網狀排列；隨著培養時間的延長，支架上的細胞逐漸由梭形變成圓形，種植７ｄ后，細胞數量明顯增加，極少細胞從支架上掉落。表明脂肪干細胞能在支架上良好地附著、生長和增殖（圖１）。
２．２細胞黏附率檢測
經檢測，７塊復合材料中，每塊細胞黏附率均達９５％以上，平均達９７．９％，說明該支架對細胞有良好的黏附性。
２．３ＸＴＴ法檢測材料上細胞增殖情況
從活細胞吸光度所繪制的細胞增殖柱形圖來看（圖２），細胞接種后，實驗組和空白組隨時間延長細胞活性逐漸增加，仍可保持正常的分裂增殖速度，兩
組之間組相比未見顯著性差異（Ｐ＞０．０５）。２．４ 掃描電鏡觀察
細胞種植 ３ ｄ 后， 細胞呈扁平多角形或圓形， 在材料表面伸展、黏附； 種植 １ 周后， 形態為梭形或圓形， 細胞數量明顯增多， 呈聚集性分布， 細胞周圍有大量基質， 表明脂肪干細胞在支架上粘附、伸展和生長良好３討論
膠原蛋白是目前組織工程學研究中最常用的天然生物材料，由多種糖蛋白分子組成，占機體總蛋白的３０％（８５％為Ｉ型膠原蛋白），它具有多方面的生物活性，不僅是組織支持物，而且是細胞外間質的重要成分。研究表明，膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調，而且可參與組織修復，是一類優良的可引導組織再生的生物材料。Ⅰ型膠原作為體外細胞培養支架時，有促進細胞粘附和誘導生長分化的作用，是良好的培養粘附劑。其降解產物可被細胞利用合成新的基質。不產生毒性代謝產物，不影響內環境ｐＨ值，因此不會影響細胞的生長增殖。膠原蛋白及相關制品已廣泛應用于臨床醫學中［５，６］，已被美國ＦＤＡ批準作為人工皮膚材料［７］。
本研究利用人脂肪干細胞作為種子細胞，進行體外細胞種植膠原支架，通過倒置顯微鏡和電鏡觀察細胞伸展、黏附和生長過程。鏡下顯示，種子細胞種植膠原材料后，生長狀態良好，無明顯細胞毒性表現，在培養條件相對穩定的情況下，細胞可以進行正常增殖、遷移并分泌細胞外基質。通過檢測，細胞與支架的黏附率達９７％以上，說明該支架對細胞有良好的親和性。
ＸＴＴ法常用于體外細胞增殖和藥敏檢測，通過測定活細胞光吸收值，間接反映活細胞數量。本實驗中，細胞支架培養復合培養后，材料接種組細胞的增殖未受到不良影響，說明Ｉ型膠原支架對人脂肪干細胞無毒性作用。
本實驗表明，人脂肪干細胞能在Ｉ型膠原支架材料上良好的附著、生長、增殖并在三維支架材料內保持均勻分布。Ｉ型膠原支架材料與人脂肪干細胞具有良好的體外生物相容性，可作為構建脂肪組織工程的細胞載體。